Межгосударственный стандарт ГОСТ 23454-2016 «Молоко. Методы определения ингибирующих веществ»

Наличие нежелательных соединений химической и биологической природы в пищевых продуктах, наряду с патогенными микроорганизмами, является значимым риском для здоровья человека. Молоко и молочные продукты могут быть загрязнены многочисленными опасными веществами. Среди потенциально опасных веществ особое место занимают так называемые ингибирующие вещества, которые независимо от их природы тормозят развитие микроорганизмов или препятствуют ему.

Выпуск безопасной и качественной молочной продукции предусматривает отсутствие в ней загрязнителей химической и биологической природы, в том числе ингибирующих веществ [1]. С учетом специфики воздействия различных ингибирующих веществ на здоровье людей, а также на технологические свойства молока решение рассматриваемой проблемы во многом зависит от разработки и внедрения эффективных методов контроля присутствия ингибирующих веществ различной природы.

На практике организация контроля наличия/отсутствия ингибирующих веществ в молоке связана как с объективными трудностями методического характера, так и со сложностью и неоднозначностью самого критерия.

Сложности методического характера определяются тем, что спектр факторов, наличие которых в молоке может стать причиной ингибирования микроорганизмов, крайне разнообразен по природе, химическому составу и порогу ингибирования. Разработка единого метода контроля наличия антимикробных факторов в молоке не может основываться на контроле количества какого-либо вещества либо группы веществ.

Объективно метод контроля наличия/отсутствия ингибирующих веществ в молоке должен заключаться в выявлении возможности нормального развития наиболее чувствительного ко всем значимым антимикробным факторам микроорганизма, который одновременно должен быть приемлем для контроля молочных продуктов в условиях производственных лабораторий. Подбор соответствующей тест-культуры, одно временно чувствительной ко всем ингибирующим веществам, является до настоящего времени самой большой и трудноразрешимой задачей.

В зарубежной практике для этих целей применяют чувствительные штаммы Bacillus stearothermophilus, а в практике отечественной системы контроля – штаммы Streptococcus thermophilus.

В отделе микробиологии ФГБНУ «ВНИИМС» в последние годы проводилось тестирование и сравнительный анализ уже известных в промышленности тест-культур, используемых для выявления наличия в молоке ингибирующих веществ, в том числе антибиотиков, а также новых штаммов Streptococcus thermophilus из российской коллекции молочнокислых микроорганизмов ФГБНУ «ВНИИМС» и ФГУП «Экспериментальная биофабрика». Результаты проведенных исследований были ранее нами опубликованы [2, 3, 4]. 

В рамках выполнения работы по совершенствованию биологического метода выявления наличия ингибирующих веществ в сыром молоке при разработке ГОСТ 23454-2016 «Молоко. Метод определения ингибирующих веществ» исследована чувствительность штаммов тест-культур Streptococcus thermophilus и Bacillus stearothermophilus к различным группам ингибирующих веществ – антибиотикам, моющим и дезинфицирующим средствам, а также к веществам, вносимым в молоко для фальсификации показателей качества, обладающих способностью подавлять развитие микроорганизмов. Установлено, что из всех штаммов Streptococcus thermophilus, имеющихся в российской коллекции молочнокислых микроорганизмов ФГБНУ «ВНИИМС» и ФГУП «Экспериментальная биофабрика», наибольшей чувствительностью к наличию ингибирующих веществ в молоке обладает штамм Streptococcus thermophilus В19.

Методика определения чувствительности тест-культур основана на сравнении интенсивности их развития в контрольном образце молока и в образцах с различным содержанием того или иного ингибитора. Контрольным образцом являлся восстановленный препарат СКИВ, гарантированно не содержащий ингибирующих веществ. Оценка проводилась на основании разработанных шкал визуальной оценки (табл. 1–3) по изменению цвета индикатора в сравниваемых пробах молока. 

Чувствительность тест-культуры Bacillus stearothermophilus определяли с использованием индикатора бромкрезолпурпур и бриллиантовый черный, а тест-культуры Streptococcus thermophilus – с применением индикатора резазурин. 

Усредненные данные чувствительности тест-культур Streptococcus thermophilus и Bacillus stearothermophilus относительно исследованных ингибирующих веществ, полученные по результатам не менее пяти повторностей, представлены в табл. 4.

В соответствии с требованиями ТР ТС 033/2013 определен допустимый уровень содержания четырех групп антибиотиков в молоке сыром: для пенициллинов – 0,004 мг/кг; тетрациклинов – 0,01 мг/кг; левомицетина – 0,0003 мг/кг; стрептомицина – 0,2 мг/кг. Как видно из данных, представленных в табл. 4, использование биологического метода позволяет выявить наличие антибиотиков только пенициллиновой группы на уровне, регламентированном ТР ТС 033/2013, как с тест-культурой Streptococcus thermophilus, так и с тест-культурой Bacillus stearothermophilus.

Установлено, что независимо от вида тест-культуры и используемого индикатора биологический метод не позволяет выявить наличие антибиотиков тетрациклиновой группы, левомицетина, стрептомицина на уровнях, регламентированных ТР ТС 033/2013. Как показывают результаты, приведенные в табл. 4, тест-культуры имеют различные уровни чувствительности относительно ненормированных ингибиторов бактериального роста: культура термофильного стрептококка показывает большую чувствительность к дезинфицирующим веществам, наиболее широко применяемым в настоящее время в молочной промышленности, – хлорсодержащим препаратам и дезинфектантам на основе перекиси водорода и надуксусной кислоты. Тест-культура Bacillus stearothermophilus имеет незначительное преимущество в выявлении поверхностно-активных веществ (сульфанол), а также формалина.

По результатам проведенных исследований в ГОСТ 23454-2017 «Молоко. Методы определения ингибирующих веществ» были включены методы как с тест-культурой Streptococcus thermophillus, так c Вас. stearothermophilus и указанными индикаторами.

Настоящий стандарт распространяется на молоко сырое цельное и обезжиренное, термически обработанное, предварительно восстановленное из сгущенного, концентрированного или сухого молока, и устанавливает методы определения ингибирующих веществ, в том числе антибиотиков; дезинфектантов на основе хлора, перекиси водорода и надуксусной кислоты; поверхностноактивных веществ; фальсифицирующих веществ, добавляемых в молоко для ограничения развития микрофлоры, в том числе перекиси водорода и формалина.

Метод определения ингибирующих веществ с использованием тест-культуры термофильного стрептококка и индикатора резазурина.

Метод основан на диагностике развития в молоке чувствительной тест-культуры Streptococcus thermophilus и восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами.

По изменению или неизменению окраски резазурина визуально оценивают отсутствие/наличие ингибирующих веществ в молоке:

• при отсутствии в молоке ингибирующих веществ тест-культура Streptococcus thermophilus развивается, и окраска резазурина меняется с серо-сиреневой на сиреневую с розовым оттенком или розовую, вплоть до белой;

• при наличии в молоке ингибирующих веществ тест-культура Streptococcus thermophilus не развивается либо ее развитие задерживается, а окраска резазурина остается серо-сиреневой или сиреневой.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке массовую концентрацию пенициллина –0,004 мг/дм3, стрептомицина – 10 мг/дм3, тетрациклина – 1 мг/дм3, левомицетина – 5,0 мг/дм3; массовую долю активного хлора – 0,06 %, перекиси водорода – 0,005 %, надуксусной кислоты – 0,005 %, сульфанола – 0,15 %, формалина – 0,004 %.

Время проведения основного анализа (без учета времени на подготовку тест-культуры) – 90 мин.

Определение ингибирующих веществ с использованием стандартного диффузионного теста, содержащего в качестве тест-культуры споры Вас. stearothermophilus var. сalidolactis и индикатор бромкрезолпурпур (Delvotest T).

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. Calidolactis и индикатором бромкрезолпурпур от фиолетовой до желтой при отсутствии в анализируемом молоке ингибирующих веществ и сохранении фиолетовой окраски при их наличии.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке массовую концентрацию пенициллина – 0,002 мг/дм3, стрептомицина – 0,5 мг/дм3, тетрациклина – 0,07 мг/дм3, левомицетина – 3,5 мг/дм3; массовую долю активного хлора – 0,1 %, перекиси водорода – 0,015 %, надуксусной кислоты – 0,009 %, сульфанола – 0,12 %, формалина – 0,002 %. Время проведения анализа – 180 мин.

Определение ингибирующих веществ с использованием теста, содержащего в качестве тест-культуры споры Вас. Stearothermophilus var. сalidolactis и индикатор бриллиантовый черный (BRT-inhibitor тест).

Метод основан на изменении цвета агаризованной среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis и индикатором бриллиантовым черным от фиолетового до желтого цвета при отсутствии в анализируемом молоке ингибирующих веществ и сохранении фиолетового цвета при их наличии.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке массовую концентрацию пенициллина – 0,003 мг/дм3, стрептомицина – 0,6 мг/дм3, тетрациклина – 0,2 мг/дм3, левомицетина – 5,0 мг/дм3, массовую долю активного хлора – 0,12 %, перекиси водорода – 0,02 %, надуксусной кислоты – 0,01 %, сульфанола – 0,12 %, формалина – 0,003 %. Время проведения анализа – 150 мин.

Сравнительный анализ методов, включенных в ГОСТ 23454-2017 «Молоко. Методы определения ингибирующих веществ», показывает, что метод определения ингибирующих веществ с использованием тесткультуры термофильного стрептококка и индикатора резазурина имеет преимущества с точки зрения чувствительности к наличию ингибирующих веществ в молоке; экспрессности (т.е. времени, необходимом для получения результата), стоимости анализа. Однако для реализации данного метода необходимо иметь возможность подготовки тест-культуры Streptococcus thermophilus в условиях микробиологической лаборатории.

Методы определения ингибирующих веществ с применением тестов, содержащих в качестве тест-культуры споры Вас. stearothermophilus var. Сalidolactis, предполагают меньшую чувствительность к ряду ингибирующих веществ, большую длительность получения готового результата и значительно большую стоимость анализа, но дают возможность, используя готовые тесты, уйти от необходимости подготовки тест-культуры.

Для реализации метода определения ингибирующих веществ тест-культуры термофильного стрептококка необходимо иметь сухую тест-культуру Streptococcus thermophilus и индикатор резазурин. При проведении анализа проб молока на наличие/отсутствие ингибирующих веществ любым из предложенных методов необходимо также иметь контрольный образец сухого молока, заведомо не содержащий ингибирующих веществ, – препарат СКИВ.

Сухая тест-культура термофильного молочнокислого стрептококка Streptococcus thermophilus, идентифицированная и паспортизированная в установленном порядке, производится на основании СТО ВНИИМС 037–2017 «Тест-культура Streptococcus thermophilus В19 для определения ингибирующих веществ» ФГУП «Экспериментальная биофабрика».

Каждая партия выпускаемой тест-культуры должна быть проверена отделом технического контроля (лабораторией) предприятия на соответствие требованиям настоящего стандарта по всем показателям.

Чувствительность тест-культуры к ингибирующим веществам в бульоне на основе гидролизованного молока должна соответствовать значениям, указанным в табл. 5. Чувствительность тест-культуры Streptococcus thermophilus В19 к ингибирующим веществам в молоке должна соответствовать значениям, указанным в табл. 6. 

Индикатор резазурин и препарат СКИВ производит и поставляет промышленности отдел микробиологии ВНИИМС, а производство чувствительной тест-культуры Streptococcus thermophilus организовано ФГУП «Экспериментальная биофабрика».

Внедрение на предприятиях отрасли методов определения наличия/отсутствия ингибирующих веществ в молоке в соответствии с ГОСТ 23454-2016 «Молоко. Метод определения ингибирующих веществ» позволит повысить гарантию безопасности выпускаемых молочных продуктов, а также снизить риски нарушения молочнокислого процесса при выработке ферментированной молочной продукции с использованием заквасочной микрофлоры.

Литература

1. Свириденко Г.М. Ингибирующие вещества – комплексный показатель безопасности молока и молочных продуктов / Г.М. Свириденко // Переработка молока. – 2014. – № 6. – С. 44–48.

2. Свириденко Г.М. Оценка биологического метода контроля ингибирующих веществ для выявления допустимого уровня содержания антибиотиков в молоке / Г.М. Свириденко, Т.В. Комарова // Сборник материалов Международной недели сыроделия и маслоделия «От истоков к современности». – Углич. – 2014. – С. 267–272.

3. Свириденко Г.М. Оценка чувствительности тест-наборов для определения антибиотиков на соответствие требованиям Технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочных продуктов» / Г.М. Свириденко, Т.В. Комарова // Сборник материалов Международной недели сыроделия и маслоделия «От истоков к современности». – Углич. – 2014. – С. 272–278.

4. Свириденко Г.М. Сравнительная оценка чувствительности тест-культур Streptococcus thermophilus и Bacillus stearothermophilus к наличию ингибиторов бактериального роста в молоке / Г.М. Свириденко, М.Б. Захарова, Т.В. Комарова // Сборник материалов Международной недели сыроделия и маслоделия «Научно-практические решения и вопросы технического регулирования производства молочной продукции». – Углич. – 2017. – С. 157–161.

Источник: Переработка молока. 2017. № 10.