Определение содержания белка в молоке методом формольного титрования: причины ошибок

Широко распространенным методом определения массовой доли белка в молоке является метод формольного титрования. Это титриметрический метод, основанный на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

Метод формольного титрования применим только к сырому молоку

Использование метода имеет ограничения: он применим только для сырого (непастеризованного) молока с кислотностью не выше 20 °Т. Однако зачастую на предприятиях молочной промышленности используют этот метод для контроля массовой доли белка в нормализованной смеси после пастеризации и даже в готовом питьевом молоке, прошедшем различную тепловую обработку при пастеризации или стерилизации.

Формальдегид добавляют в сырое молоко с целью сделать доступными карбоксильные группы белка для титрования щелочью

Чтобы понять, почему этого нельзя делать, рассмотрим химизм метода формольного титрования. Как известно, для молекул белка характерно присутствие положительно заряженных амино-групп (―NH3⁺) и отрицательно заряженных карбоксильных групп (―СОО¯). Находясь в одной молекуле, разноименно заряженные амино- и карбоксильные группы притягиваются друг к другу, образуя внутреннюю комплексную соль нейтрального характера. Это препятствует взаимодействию щелочи (гидроксида натрия) с карбоксильными группами.

Для того чтобы высвободить карбоксильные группы моноаминодикарбоновых кислот белков, сделать их доступными для титрования щелочью, в молоко добавляют формальдегид (формалин), который взаимодействует с амино-группами белков, блокируя их. А карбоксильные группы освобождаются и становятся доступными для титрования гидроксидом натрия.

Во время температурной обработки молочного сырья в белковых мицеллах происходят сложные изменения

При пастеризации и стерилизации молока под воздействием высокой температуры происходят сложные конформационные изменения белковых молекул. Термолабильные сывороточные белки денатурируют, взаимодействуют с κ-казеином, осаждаясь на поверхности мицелл казеина. Это приводит к увеличению размеров мицелл. Но в то же время происходит отщепление низкомолекулярных соединений от белков, в том числе коллоидного фосфата кальция, который является связующим звеном в виде фосфорно-кальциевых мостиков между субмицеллами в мицелле казеина. Это приводит к распаду мицелл на более мелкие образования.

При пастеризации наблюдается образование агломератов из более мелких, чем в сыром молоке, частиц казеина

Кроме того, κ-казеин может терять гликомакропептиды, вследствие чего мицеллы уменьшаются в размерах, а также теряют устойчивость и частично агрегируют. Это явление иллюстрируют электронно-микроскопические фотографии сырого молока и молока пастеризованного (рисунок 1).

В данном случае при пастеризации молока в течение 30 с при температуре 75 °С наблюдается образование агломератов из более мелких, чем в сыром молоке, частиц казеина.

Очевидно, что в зависимости от кислотности молока, температуры и продолжительности теплового воздействия будут преобладать те или иные изменения, внешне проявляющиеся в изменении (уменьшении или увеличении) размеров мицелл.

В результате этих преобразований существенно меняется количество доступных для титрования карбоксильных групп по сравнению с нативным состоянием белка в сыром свежем молоке, что отражается на результатах измерений массовой доли белка методом формольного титрования: он будет давать неправильные результаты.

На рисунке 2 показано влияние продолжительности выдержки молока при температуре 80±2 °С на результаты определения белка этим методом.

Из представленных данных видно, что после 10 мин выдержки при данной температуре происходит существенное увеличение измеренных значений массовой доли белка. После 30 мин выдержки в пастеризованном молоке результат превысил значения, полученные для сырого молока, на 0,7 %. При этом метод Кьельдаля на протяжении всего исследованного периода выдержки показал результат 3,83±0,12 %.

Метод формольного титрования можно применять на нормализованных по жиру смесях, не прошедших пастеризацию

Таким образом, во избежание ошибок при определении массовой доли белка методом формольного титрования нельзя нарушать область его распространения, которая ограничивается только сырым молоком.

При этом следует отметить, что метод формольного титрования можно применять для определения белка в нормализованных по жиру смесях, идущих на производство молочных продуктов, но только до того, как смесь пойдет на пастеризацию.

Все сырое молоко, соответствующее требованиям ТР ТС 033/2013, ГОСТ 31449-2013 и ГОСТ Р 52054-2003 по показателю титруемой кислотности, подходит для определения в нем массовой доли белка методом формольного титрования

Что касается кислотности сырого молока, которая должна быть не более 20 °Т, то это ограничение на использование метода формольного титрования также связано со структурными изменениями белка. Вместе с тем оно не входит в противоречие с требованиями Технического регламента Таможенного союза 033/2013 «О безопасности молока и молочных продуктов», межгосударственного стандарта ГОСТ 31449-2013 «Молоко коровье сырое. Технические условия» и национального стандарта ГОСТ Р 52054-2003 «Молоко коровье сырое. Технические условия», в которых верхний предел значений титруемой кислотности сырого молока, принимаемого на переработку, равен 21 °Т включительно. С учетом установленных границ абсолютной погрешности (±1,9 °Т для индикаторного метода измерения и ±0,8 °Т для потенциометрического) все сырое молоко, отвечающее требованиям указанных документов по показателю титруемой кислотности, может быть объектом для определения в нем массовой доли белка методом формольного титрования. Однако если все же в нарушение установленных требований предприятие приняло для переработки молоко с повышенной кислотностью, то рассчитывать на корректные результаты измерений массовой доли белка этим методом не следует.

К неточным результатам определения массовой доли белка методом формольного титрования могут привести также следующие причины:

– игнорирование использования эталона окраски, на который следует ориентироваться при проведении титрования;

– использование формалина без предварительной нейтрализации гидроокисью натрия;

– использование формалина с концентрацией формальдегида меньше 37 %;

– использование гидроокиси натрия концентрацией, отличающейся от 0,1 N.

Источник: Сборник научных трудов к 75-летию со дня основания ВНИИМС" Научные подходы к решению актуальных вопросов в области переработки молока". – 2019. – С. 232-235.