Исследование содержания ацилтрансферазы в молочных продуктах

В настоящее время новым перспективным направлением в пищевой энзимологии является модификация структуры белков. С этой целью может быть использована трансглютаминаза. Трансглютаминаза – фермент, относящийся к классу ацилтрансфераз (по международной классификации ЕС 2.3.2.13), катализирует 3 типа реакций:

• Реакцию ацильного переноса;

• Реакцию образования ковалентных связей между аминокислотными остатками лизина и глутамина в белках;

• Реакцию дезаминирования.

В результате связывания глутаминового и лизинового остатков пептидов или белков образуются высокомолекулярные соединения, содержащие ε-(γ-глутамил) лизиновые внутри- и межмолекулярные связи. Эти связи могут влиять на структуру и функциональные свойства белков. Модификация белков с помощью трансглютаминазы позволяет изменить их растворимость, гидратирование, термостабильность, а также их желирующие, реологические свойства, эмульгирование и сычужную свертываемость.

Использование трансглютаминазы повышает выход белковых продуктов за счет повышения степени использования сухих веществ и массовой доли влаги

В предшествующих публикациях нами показано, что при использовании микробной трансглютаминазы (мТГ) в молочных продуктах наблюдается меньшее нарастание титруемой кислотности при изготовлении и хранении, также они имеют более высокую вязкость в сравнении с молочными продуктами, выработанными без использования трансглютаминазы. Кроме того, использование мТГ способствует повышению выхода белковых продуктов за счет повышения степени использования сухих веществ и массовой доли влаги. Безусловно, такие свойства данного фермента весьма привлекательны для производителей пищевой продукции.

Разрешено применение трансглютаминазы только производства компании Ajinomoto и только с использованием в качестве продуцента Streptoverticillium mobaraense, штамм S-8112

Что касается законодательных аспектов применения мТГ, проведенный анализ требований нормативных правовых актов, находящихся в открытом доступе, показал, что в США Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration) разрешено применение трансглютаминазы только производства компании Ajinomoto и только с использованием в качестве продуцента Streptoverticillium mobaraense (штамм S-8112), причем в случае применения мТГ требуется указание этого факта на маркировке. В Европе данный вопрос с марта 2005 года находится в стадии рассмотрения вследствие большого количества представленных к изучению пакетов документов на ферментные препараты (более 300), причем среди указанных пакетов документов всего три на препараты трансглютаминазы (кроме компании Ajinomoto еще два подано от компании DSM).

Использование микробной трансглютаминазы на территории Таможенного союза является незаконным

В странах Таможенного союза статус ферментов для пищевой промышленности определяется техническим регламентом Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012 с изменениями на 18 сентября 2014 года). В указанном документе среди ферментных препаратов микробного происхождения трансглютаминаза, а также микроорганизмы-продуценты данного фермента не упоминаются. Следовательно, использование микробной трансглютаминазы на территории Таможенного союза является незаконным.

В зарубежных научных публикациях содержатся сведения о следующих методах, выявления трансглютаминазы в составе пищевых продуктов:

– методы, основанные на определении отклонения структурных (реологических) показателей мясных продуктов от типичных значений. Метод не позволяет в реальности установить факт применения трансглютаминазы, поскольку изменение может быть вследствие использования желирующих агентов (альгинаты), либо ферментов (фибриноген-тромбин);

– метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на выявлении в продукте остатков ДНК микроорганизма-продуцента трансглютаминазы Streptoverticillium mobaraensis, которые не удаляются из ферментного препарата трансглютаминазы при его очистке. При использовании данного метода устанавливается наличие не самой трансглютаминазы, а следов ДНК, наличие которых может быть очень мало и находиться за пределами чувствительности метода. Также отсутствует возможность обнаружения трансглютаминазы, полученной от иного микроорганизма-продуцента;

– метод с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором, при котором выявляется наличие специфических пептидов, образующихся при гидролизе трансглютаминазы трипсином;

– иммуноферментный метод (ELISA detection determination of Microbial Transglutaminase).

Российским производителем реагентов ООО «ХЕМА» совместно с ФБГУ «Ростовский референтный центр Россельхознадзора» разработана, зарегистрирована в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений и 11 февраля 2019 года аттестована ФГУП «Уральский научноисследовательский институт метрологии» методика измерения массовой доли микробной трансглютаминазы в пробах пищевой продукции методом иммуноферментного анализа (ИФА).

В конце декабря 2019 года Россельхознадзор сообщил о намерении включить в систему госмониторинга исследование продуктов на наличие мТГ с использованием вышеназванной методики, и уже в феврале-марте 2020 года в связи с фактами выявления мТГ в имитированной пищевой рыбной продукции Россельхознадзор ввел режим усиленного лабораторного контроля в отношении продукции, выпускаемой одним из белорусских предприятий.

Кроме того, пресс-службой Россельхознадзора сообщается, что с целью количественного выявления мТГ в продуктах питания в перспективе будет разработана новая методика, основанная на высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

В связи с изложенным, с целью предупреждения возникновения возможных нарушений молокоперерабатывающими предприятиями Беларуси требований технических регламентов Таможенного союза, и, как следствие, введения ограничений со стороны России на поставки молочной продукции, возникает необходимость контроля остаточного содержания мТГ в различных молочных продуктах.

Цель данных исследований – определение остаточного содержания мТГ в различных молочных продуктах.

Объектами исследований являлись молочные продукты, выработанные без использования мТГ:

• Йогурт;

• Ряженка;

• Сметана;

• Творог (изготовленный с использованием различных температур отваривания);

• Сыр;

• Молочные продукты с мТГ, изготовленные по технологии вышеперечисленных продуктов.

Выработки и исследование контрольных образцов молочных продуктов (творог, кисломолочный продукт) и экспериментальных образцов молочных продуктов, изготовленных по технологии творога и кисломолочного продукта с добавлением мТГ проводились в лаборатории технологий сыроделия и маслоделия, лаборатории цельномолочных продуктов и концентратов и производственно-испытательной лаборатории РУП «Институт мясо-молочной промышленности».

Для выработки экспериментальных образцов с мТГ использовался ферментный препарат Saprona MCC LM.

Сквашивание проводилось с использованием заквасок для производства йогурта, сметаны, ряженки и творога (изготовитель – РУП «Институт мясо-молочной промышленности»).

Определение остаточного содержания мТГ в молочных продуктах осуществлялось в производственно-испытательной лаборатории РУП «Институт мясо-молочной промышленности» с использованием:

- методики измерений массовой доли мТГ в пробах продуктов питания методом ИФА, разработанной ООО «Хема»;

- методики определения мТГ с использованием иммунохроматографического теста для качественного определения трансглутаминазы производства ООО «АНКАР-ИМЭК».

Иммунохроматографический тест для качественного определения трансглутаминазы ООО «АНКАР-ИМЭК» использован с целью оценки сопоставимости полученных результатов, т.к. указанная методика пока не прошла процедуру аккредитации и официально не может быть использована государственными учреждениями.

Имеется ряд публикаций, ставящих под сомнение возможность определения остаточной активности мТГ в пробах пищевой продукции, объясняя это тем, что мТГ теряет активность при воздействии кислорода, рН, температуры, а также от выработки рабочего ресурса фермента. В производстве молочных продуктов в случае внесения мТГ после пастеризации сырья, температурная инактивация указанного фермента не проходит, но есть научные работы, подтверждающие необратимую потерю активности при достижении определенного значения рН.

Для исследования остаточного содержания мТГ в сквашенных молочных продуктах были изготовлены продукты по технологии йогурта, сметаны и ряженки с внесением ферментного препарата мТГ до пастеризации сырья и после пастеризации сырья. Температурный режим пастеризации – (92±2°С) с выдержкой 10–15 с. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты исследований по определению остаточного содержания мТГ в сквашенных молочных продуктах

Как видно из полученных результатов (таблица 1), мТГ не была обнаружена во всех исследованных контрольных образцах молочных продуктов, а также продукте, выработанном по технологии йогурта с внесением трансглютаминазы до пастеризации сырья. Следовательно, температура (92±2)°С с выдержкой 10–15 с является достаточной для инактивации фермента мТГ в молочных продуктах. Кроме того, установлено, что в случае внесения фермента после пастеризации сырья мТГ обнаруживается в продукте, выработанном по технологии ряженки даже после 27 суток его хранения.

Для исследования остаточного содержания трансглютаминазы в высокобелковых продуктах, были выработаны продукты по технологии творога с внесением мТГ до и после пастеризации сырья. Температурный режим пастеризации – (78±2)°С с выдержкой 15–20 с, отваривания – (44±2)°С в течение 100 мин. Как видно из полученных результатов (таблица 2, образцы 1,2,3), мТГ не была обнаружена в контрольном образце творога, а также продуктах, выработанных по технологии творога с внесением указанного фермента как до пастеризации, так и после пастеризации сырья. Температура тепловой обработки творожного сгустка в данном случае недостаточна для инактивации фермента. Следовательно, отрицательная реакция на наличие мТГ может быть обусловлена совместным действием температуры и продолжительности отваривания молочного продукта по технологии творога. С целью установления влияния тепловой обработки творожного сгустка на вероятность обнаружения мТГ был выработан молочный продукт по технологии творога с внесением мТГ после пастеризации сырья при указанных выше температурных режимах с быстрым охлаждением сгустка после отваривания. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Из результатов, представленных в таблице 2 можно сделать вывод, что при быстром охлаждении творожного сгустка трансглютаминаза сохраняется и может быть обнаружена. Таким образом, на линиях по производству творога (например, «Tewes-Bis»), когда одновременно действуют два фактора – температура отваривания порядка 60°С и достаточно продолжительное время выдержки – остаточная активность мТГ может не обнаруживаться даже в случае использования указанного ферментного препарата.

Таблица 2 – Результаты исследований по определению остаточного содержания мТГ в молочных продуктах по технологии творога с различными стадиями внесения препарата

С целью определения сохранности трансглютаминазы в сырных продуктах и подсырной сыворотке, была проведена соответствующая выработка продуктов по технологии сыра. Внесение мТГ осуществлялось после пастеризации молочного сырья при (72±2)°С с выдержкой 10–15 с. Результаты исследований по определению содержания мТГ в продуктах, выработанных по технологии сыра и сыворотке подсырной, представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Результаты исследований по определению остаточного содержания мТГ в продуктах, выработанных по технологии сыра и сыворотке подсырной

Анализ полученных результатов показывает, что мТГ обнаруживается в подсырной сыворотке и сырных продуктах как непосредственно после выработки, так и после созревания в течение четырех и девяти месяцев.

Заключение. С использованием методики измерений массовой доли микробной трансглютаминазы в пробах продуктов питания методом ИФА ООО «Хема» и методики качественного определения трансглютаминазы с использованием иммунохроматографического теста производства ООО «АНКАРИМЭК» проведен анализ наличия остаточной активности микробной трансглютаминазы в контрольных образцах йогурта, ряженки, сметаны, творога (изготовленного с использованием различных режимов отваривания), сыра и молочных продуктов с микробной трансглютаминазой, изготовленных по технологии вышеперечисленных продуктов. Установлено наличие остаточной активности мТГ во всех исследованных видах готовой продукции, изготовленной с ее внесением после пастеризации сырья, за исключением творога, полученного способом кислотной коагуляции на линиях типа «Tewes-Bis».

Источник: Сборник научных трудов «Актуальные вопросы переработки мясного и молочного сырья», выпуск 15, С. 104-109.