Определение триптофана в молоке методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза

Важнейшим показателем питательной ценности молока и молочных продуктов является содержание аминокислот. Одной из незаменимых аминокислот, поступающих в организм только с пищей, является триптофан. В достаточно большом количестве данная аминокислота присутствует в белках молока и молочных продуктах, таких как творог и сыр.

До недавнего времени для анализа аминокислотного состава пищевых продуктов и сырья преимущественно использовали аминокислотные анализаторы на основе ионообменной хроматографии, что вызывало ряд трудностей. 

Весьма перспективной для определения аминокислотного состава представляется разработка методик с использованием оборудования, которое нашло широкое распространение в аналитических лабораториях – ВЭЖХ и капиллярный электрофорез.

На сегодняшний день существует ряд нормативных документов, регламентирующих определение различных аминокислот, включая триптофан. В основе данных документов лежит использование методов капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработка методов определения аминокислотного состава молока и молочных продуктов с применением современных способов анализа является важной задачей в связи с отсутствием отработанных методик для определения данного показателя.

Целью проведения исследования являлась сравнительная оценка определения содержания триптофана в коровьем молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза с использованием различных видов детектирования.

Пробоподготовка образца молока включала гидролиз, необходимый для разложения белковых соединений до аминокислот. Вследствие разрушения триптофана при кислотном гидролизе для его определения используют щелочной гидролиз, который разрушает большую часть других протеиногенных аминокислот. В качестве основания, используемого для гидролиза, чаще всего применяют гидроксид бария, так как ионы бария могут быть легко осаждены из раствора. Осаждение необходимо по причине того, что катионы могут оказывать негативный эффект на последующую стадию превращения аминокислот во флуоресцирующие производные. Так как триптофан обладает собственной способностью флуоресцировать под воздействием УФ-света с определенной длиной волны, то допускается исключение стадии дериватизации и, таким образом, можно использовать другой щелочной агент вместо гидроксида бария. Гидролиз пробы коровьего молока проводили с использованием двухмолярного раствора гидроксида натрия в течение 16 часов при температуре 110°С. После проведения гидролиза аликвоту полученного гидролизата помещали в мерную колбу и разводили деионизованной водой в 10 раз. Для установления нейтрального pH к раствору пробы добавляли несколько капель фенолфталеина в качестве индикатора и нейтрализовывали раствором соляной кислоты, фиксируя переход окраски раствора из малинового в бесцветный. При исследовании содержания триптофана методом капиллярного электрофореза использовали подготовленный раствор, предварительно профильтрованный через мембранный фильтр. При исследовании методом ВЭЖХ аликвоту полученного нейтрализованного раствора дополнительно разбавляли в 10-50 раз.

Определение содержания триптофана в гидролизате молока осуществляли на системе капиллярного электрофореза Agilent 7100 со спектрофотометрическим детектором при длине волны 219 нм с использованием боратного буферного раствора (рН 9,2) при напряжении 20 кВ. Время анализа составило 10 минут. Минимально определяемая концентрация триптофана в растворе составила 1 мг/л. Аналогичный эксперимент по определению содержания триптофана был проведен с использованием жидкостного хроматографа Ultimate 3000 с флуориметрическим детектором (длина волны возбуждающего излучения – 280 нм, длина волны испускания – 356 нм) на обращенно-фазовой колонке с использованием в качестве элюента смеси ацетонитрила с добавкой изопропилового спирта и ацетатного буфера. При определении триптофана методом ВЭЖХ минимальный предел обнаружения триптофана в растворе составил 0,01 мг/л. Время анализа составило 15 минут.

Полученные значения концентрации триптофана в исследованной пробе молока с использованием двух методов оказались сходными и указывают на их высокую воспроизводимость. 

Заключение. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием имеет более низкий предел обнаружения по сравнению с методом капиллярного электрофореза со спектрофотометрическим детектированием. 

Установлено, что в обоих случаях наличие пиков других соединений не мешает количественному определению триптофана. 

В качестве щелочного агента при гидролизе молока возможно применение гидроксида натрия. 

Источник: Инновационное развитие аграрно-пищевых технологий: материалы междунар. науч.-практ. Конф. - 2021 – 14-16 с.