Наука

Контроль содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в продуктах питания на территории РФ

Шубина Е.Г., Грудев А.И., Другова О.П., Белоусов В.И, Сатюкова ЛЛ., Черных О Ю .
Федеральное государственноебюджетное учреждение «Центральнаянаучно-методическая ветеринарная лаборатория», г. Москва
Среди контаминантов продовольственного сырья и пищевых продуктов важное место занимают остатки антимикробных ветеринарных препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекционных за¬болеваний животных и птицы, в том числе антибиотики тетрациклиновой группы.  В статье  рассмотрена  проблема  обнаружения  антибиотиков тетра¬циклиновой  группы на территории  Российской Федерации,  проанализирова¬но  влияние  этих  веществ  на  здоровье  человека,  приведен  сравнительный анализ  максимально  допустимых  концентраций  тетрациклинов  в  пищевых продуктах в странах Таможенного Союза  и Евросоюза,  рассмотрены сущес¬твующие лабораторные  методы определения  концентрации  этих  веществ  в пищевых  продуктах,  проведены  исследования  различных  видов  пищевых продуктов  животного  происхождения  на  наличие  антибиотиков.  Авторами также проанализировано международное законодательство по остаткам антибиотиков в пищевых продуктах, испытаны  различные методы  пробоподго¬товки для эффективного выделения остатков антибиотиков из мяса,  молока, рыбы,  мёда  и усовершенствована  методика  анализа.  На наличие тетрациклинов в 2017-2018 годах исследовано 76 512 проб пищевых продуктов, и в 1 077 (1,4%) были выявлены остатки антибиотиков тетрациклиновой группы. Анализ показал, что из всех положительных проб антибиотики тетрациклинового ряда занимают 12%.  Выявление остаточного содержания антибак¬териальных препаратов, в частности антибиотиков тетрациклиновой группы, в продуктах питания - важная задача государственной ветеринарной служ¬бы. Лаборатории Россельхознадзора постоянно оснащаются современным оборудованием и проводят научно-исследовательские работы по разработке новых более эффективных методик определения остатков лекарственных средств в продуктах животного происхождения.
28.06.2021

Введение. Среди контаминантов продовольственного сы­рья и пищевых продуктов важное место занимают остатки антимикробных ветеринарных препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных и птицы, в том числе антибиотики тетрациклиновой группы. Тетрациклины представляют собой группу антибактериальных пре­паратов, часто используемых из-за своего широкого спектра дейст­вия, а также их низкой стоимости по сравнению с другими антибиоти­ками. В настоящее время эта группа включает более 20 соединений, однако, наиболее распространенными в ветеринарной медицине являются тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин и доксициклин [10, 11].

Помимо терапевтических целей тетрациклины иногда добавляют в корм для скота в субтерапевтических дозах в качестве стимуляторов роста для выращивания свиней, птицы и аквакультуры [11].В середине XX века активно изучалось и практиковалось приме­нение антибиотиков в качестве консервантов продуктов питания. Исследователи отмечали, что антибиотики тетрациклинового ряда предотвращают порчу мясных продуктов, а хлортетрациклин являет­ся превосходным консервантом для рыбы [8]. В настоящее время во многих странах эта практика запрещена, но недобросовестные производители могут добавлять тетрациклины и другие антибиотики в пищевую продукцию для продления её срока годности и обеспечения её микробиологической безопасности. Бесконтрольное использование антибиотиков тетрациклиновой группы несёт в себе много рисков для здоровья человека и окружа­ющей среды. Наиболее значимым из них является возникновение устойчивости штаммов микроорганизмов к этим антибиотикам [14], что в будущем делает лечение этими препаратами бесполезным, гены устойчивости к антибиотикам и мобильные молекулы ДНК, появивши­еся в результате злоупотребления антибиотиками, следует рассмат­ривать как ксеногенные загрязнители, которые реплицируются, а не разлагаются при попадании в окружающую среду [11]. Кроме этого, тетрациклины имеют побочные эффекты и противопоказания. Напри­мер, при лечении этими препаратами у некоторых пациентов возни­кают нежелательные реакции со стороны различных систем органов: тошнота, рвота, диарея, головокружение, вагинальный кандидоз, ток­сическое поражение печени (высокие дозы тетрациклинов, особенно у беременных и пациентов с ранее существовавшим заболеванием печени, могут нарушать функцию печени и приводить к некрозу пе­чени), токсическое поражение почек (хотя тетрациклины не являются напрямую нефротоксичными, но они могут усугубить существующую почечную дисфункцию), тетрациклины, особенно демеклоциклин, мо­гут вызывать повышенную чувствительность кожи к ультрафиолетово­му излучению. Тетрациклины также противопоказаны беременным женщинам, так как вызывают аномалии развития зубов и костей у плода [12].В связи с вышеизложенным, необходим строгий контроль за со­держанием антибиотиков тетрациклиновой группы. ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лабора­тория» в рамках мониторинговых исследований и государственного задания ежегодно осуществляет контроль продуктов животного про­исхождения и кормов на наличие антибиотиков тетрациклинового ряда с использованием наборов для иммуноферментного анализа и метод ВЭЖХ с флуоресцентным, УФ- и масс-спектрометрическими детекторами (пределы обнаружения составляют 0,1-1 мкг/г), а также совершенствует методы выявления в пищевых продуктах указанных антибиотиков. В своей работе мы проанализировали международное законода­тельство по остаткам антибиотиков в пищевых продуктах, испытали различные методы пробоподготовки для эффективного выделения остатков антибиотиков из мяса, молока, рыбы, мёда и усовершенс­твовали методику анализа.


Результаты исследований и их обсуждение. В странах Тамо­женного союза содержание антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции регламентировано тремя основными документа­ми: ТР ТС 021/2011 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» [4], ТР ТС 033/2013 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» [7] и ТР ТС 034/2013 Технический регламент Таможенно­го союза «О безопасности мяса и мясной продукции» [5]. Глобальным ориентиром для потребителей, производителей и переработчиков пи­щевых продуктов является Кодекс Алиментариус [6]. В Европейском союзе существуют свои нормы Содержания Антибиотиков в продуктах питания, зафиксированные в Постановление Европейской комиссии No 37/2010. По фармакологически активным веществам и их класси­фикации в отношении максимальных пределов остатков в пищевых продуктах животного происхождения [9, 13]. В таблице 1 представле­ны требования различных нормативных документов по содержанию четырех наиболее распространенных антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции для некоторых матриц.

ТР ТС 021/2011, ТР ТС 033/2013 и Кодекс Алиментариус регла­ментируют содержание нескольких антибиотиков тетрациклиновойгруппы в целом, тогда как Постановление Европейской комиссии рас­сматривает каждый антибиотик по отдельности.Как видно из таблицы 1 на территории Таможенного Союза уста­новлены жесткие требования содержания антибиотиков тетрацик­линовой группы, в 10-60 раз ниже, чем в Европейском союзе. Для надзора за соблюдением этих требований в России созданы феде­ральные и региональные лаборатории, которые оснащены совре­менными приборами, способными выявлять остатки тетрациклинов в пределах 0,1-1 мкг/г.Существуют различные методики определения антибиотиков тет-рациклиновой группы. В лабораторной практики они делятся на две части: скрининговые методы и подтверждающие методы. Применяется экспресс-тест «Tetra Star», основанный на анализе специфического рецептора тетрациклиновой группы, имеет высокую чувствительность (2 до 50 мкг/кг). Микробиологический тест «Copan Test» включает споры Bacillus stearothermophilus calidolactis, с высо­кой чувствительностью определяет антибиотики группы р-лактамов, тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов и других антибиотиков. Тест, включающий микроорганизмы вида Streptocoecus thermophilusпредложен для определения пенициллина, стрептомицина и тетрацик­лина в молоке [2]. Пределы обнаружения составляют 0,01 МЕ/мл,10 мкг/мл и 1 мкг/мл, соответственно. Антибиотики тетрациклинового и хинолонового ряда могут также выявляться люминесцентным методом. В ряде исследований для снижения пределов обнаружения, повышения селективности, либо уменьшения времени проведения анализа применяется твердофазная спектрофлуориметрия. Методи­ка предусматривает определение тетрациклина в курином мясе не­посредственно в фазе сорбента по люминесценции его комплекса с ионом Eu (III) [1]. Разработаны методики электрохимического опреде­ления антибиотиков тетрациклинового ряда (окситетрациклина, мета- циклина и тетрациклина) в молоке с использованием амперометри­ческого титрования и ионометрии. К скрининговым относятся также методы иммуноферментного анализа (ИФА). Эти методы основаны на специфической реакции антиген-антитело. Анализ осуществляется с помощью тест-наборов различных производителей. Эти методы отли­чаются производительностью, высокой чувствительностью и сравни­тельно невысокой стоимостью, но в редких случаях могут показывать ложные результаты. В настоящее время метод ИФА развивается, по­являются более надежные тест-системы, расширяется область их при­менения. 

Также на основе этого метода создана технология микрочи­пов, используемая в приборах Randox, где повышена селективность и точность анализов. Пределы обнаружения антибиотиков указанными методами составляют 0,01-0,05 мкг/мл.Однако по действующим российским и международным нормам положительные результаты скрининговых анализов должны быть обязательно проверены подтверждающими методами, к ним отно­сится метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс- спектрометрическим детектором (ВЭЖХ МС/МС). На территории Россий­ской Федерации действует один стандарт на определение остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой про­дукции подтверждающим методом - ГОСТ 31694-2012 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высо­коэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометриче­ским детектором» [3]. Этот метод рассчитан на определение четырех основных антибиотиков тетрациклиновой группы в объектах животно­го происхождения. Помимо этой универсальной методики в России группами исследователей создаются более быстрые и экономичные методики пробоподготовки к анализу антибиотиков тетрациклиновой группы методом ВЭЖХ М С/М С [1, 2, 7].Развитие и внедрение в практику методик ВЭЖХ М С/М С идет в сторону расширения области исследуемых матриц и аналитов, так как в отдельных случаях антибиотики могут попадать в растительное сырье и объекты окружающей среды, кроме того с развитием ветери­нарии и медицины помимо четырех основных тетрациклинов могут применяться и другие антибиотики этой группы. Для выделения анти­биотиков из анализируемых образцов применяют различные методы экстракции с целью повышения пределов обнаружения остатков ан­тибиотиков (органические растворители, твердофазная экстракция). Пределы обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах прибор­ным методом составляют 1-5 мкг/г.

Нами, в 2018 году изучена сорбция тетрациклинов на сорбентах различной природы и концентрирование этих соединений для опре­деления в матрицах методом ВЭЖХ МС/МС. Разработаны способы пробоподготовки для извлечения тетрациклинов из мяса, молока, рыбы и меда (водных и водно-органических растворов). Наилучшие результаты были получены при использовании сверхшитого полисти­рола. Уровень выделения тетрациклинов при этом составил 92-99,9%. Выбраны также условия разделения окситетрациклина, хлортетрацик­лина и доксицилина на колонках со сшитым полистиролом и смесью ацетонитрила и фосфорной кислоты. Повсеместному внедрения в ветеринарную практику методов ВЭЖХ М С/М С мешает высокая цена на оборудование, наличие ква- 2 2 лифицированных кадров, сложности технического обслуживания. Та­кие приборы в достаточных количествах могут позволить себе только крупные испытательные лаборатории.


Снимок экрана 2021-06-26 150701.png


Продукты животного происхождения на остаточное содержание ан­тибиотиков контролируются государственными ветеринарными лабо­раториями в рамках государственных заданий. Всего было проведено234 256 (2017 год) и 237 223 (2018 год) лабораторных исследований образцов от 14 видов продукции (мясо всех видов животных, рыбаи рыбопродукты, нерыбные объекты промысла, молоко и молочные продукты, яйца и продукты их переработки, мёд, корма).В структуре исследуемых показателей при выполнении плана мо­ниторинга безопасности пищевых продуктов и кормов на антибиоти­ки приходилось 8,9% (рисунок 1).На наличие тетрациклинов в 2017 году исследовано 27 289 проб пищевых продуктов и в 633 (2,3%) были выявлены остатки антибиоти­ков тетрациклиновой группы; в 2018 году исследовано 49 223 пробы и выявлено 444 (1,5%) положительных проб. Анализ показал, что из всех положительных проб антибиотики тетрациклинового ряда зани­мают 12%.



Снимок экрана 2021-06-26 150833.png

Нами в 2017, 2018 и первой половине 2019 года были проведены исследования образцов пищевых продуктов на наличие антибиотиков тетрациклиновой группы подтверждающим методом (ВЭЖХ МС/МС)с целью подтверждения результатов, полученных скрининговыми ме­тодами. Результаты приведены на рисунке 2 и зарегистрированы в электронной системе «Веста».

Снимок экрана 2021-06-26 150954.png

Из рисунка 2 видно, что объем исследований в 2018 году сущест­венно вырос, а в 2019 году планируется превышение объема иссле­дований 2018 года. Этому способствует рост уровня технического ос­нащения лабораторий и профессиональный рост сотрудников. Сравнительный анализ процента положительных проб за 2017и 2018 годы продемонстрировал снижение выявляемости антиби­отиков в исследованных пробах пищевых продуктов, что свидетель­ствует о более эффективном контроле ветеринарных специалистов за применением лекарственных средств при выращивании животных, убое животных и использования продуктов животного происхождения после их лечения. 

Заключение. Выявление остаточного содержания антибактери­альных препаратов, в частности антибиотиков тетрациклиновой груп­пы, в продуктах питания - важная задача государственной ветеринар­ной службы. В России она решается на федеральном и региональном уровнях в рамках выполнения ежегодных программ по мониторингу безопасности пищевых продуктов и кормов в федеральных государст­венных бюджетных учреждениях Россельхознадзора и региональных государственных ветеринарных лабораториях субъектов Российской Федерации. Лаборатории Россельхознадзора постоянно оснащаются современным оборудованием и проводят научно-исследовательские работы по разработке новых более эффективных методик определе­ния остатков лекарственных средств в продуктах животного происхож­дения.

Список литературы:

1. Амелин В.Г., Андоралов А.М., Волкова Н.М., Коротков А.И., Никешина Т.Б., Сидоров И.И., Тимофеев А.А. Идентификация и определение токсикантов с использованием стандартной добавки в пищевых продуктах, продовольст­венном сырье и кормах методом высокоэффективной жидкостной хрома­тографии/ время пролетной масс-спектрометрии высокого разрешения// Аналитика и контроль. 2015. Т. 19. No 2.

2. Коротков А.И., Амелин В.Г Экспресс-определение тетрациклинов в молоке методом масс-спектрометрии высокого разрешения// Известия Са­ратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2015. Т. 15. Вып. 2. С. 8-13.

3. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометричес­ким детектором. ГОСТ 31694-2012.

4. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции». ТР ТС 021/2011.

5. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции». ТР ТС 033/2013.

6. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции». ТР ТС 034/2013.

7. Удалова А.Ю. Сорбционное концентрирование антибиотиков тетрациклиновой группы для их последующего определения. Автореферат на соиска­ние ученой степени к.х.н. Москва, 2015. 129 с.

8. Deatherage F.E. Use of Antibiotics in the Preservation of Meats and Other Food Products. // American Journal of Public Health. 1957. V. 47. P. 594-600.

9. European Commission, Commission Regulation (EU). No 37/2010 of 22 December 2009. On pharmacologically active substances and their classification, regarding maximum residue limits in food stuffs of animal origin.

10. Fritz J. W. and Zuo Y. Simultaneous determination of tetracycline, oxytetracycline, and 4-epitetracycline in milk by high performance liquid chromatography. Food Chemistry. 2007. V. 105. N. 3. P. 1297-1301.

11. Granados-Chinchilla F., Rodriguez C. Tetracyclines in Food and Feeding stuffs: From Regulation to Analytical Methods, Bacterial Resistance, and Environmental and Health Implications// Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2017. V. 2017. Article ID 1315497. 24 p.

12. Katzung B.G., Kruidering-Hall M., Trevor A.J./ Pharmacology Examination & Board Review, 11th ed.; Mc-Graw Hill Medical: Minneapolis, MN, USA. 2010. 586 pp.

13. Maximum residue limits (MRLs) and risk management recommendations (RMRs) for residues of veterinary drugs in foods. FAO/WHO. CAC/MRL 2-2015, Updated as at the 38th Session of the Codex Alimentarius Commission (July 2015).

14. Nguyen F., Starosta A.L., Arenz S., Sohmen D., Donhofer A., Wilson D.N. Tetracycline antibiotics and resistance mechanisms// Biological Chemistry. 2014. N. 395 (5). P. 559-575.









Источник: Ветеринария Кубани. 2021. № 1. С. 22-25.