Выявление фальсификации бесконтактным методом

В настоящее время появился новый тип экономичных настольных приборов ядерного магнитного резонанса (ЯМР), преимуществами которых являются неинвазивность и недеструктивность диагностики [4, 6, 9].

Известным применением ЯМР в пищевой индустрии является стандарт ИСО по определению концентрации твердого жира в молочных продуктах [15]. Кроме того, известны ЯМР-спектроскопический метод определения концентрации уксусной кислоты как индикатора порчи вина в закрытой бутылке [16]; ЯМР-анализатор фирмы Intermagnetics для контроля качества молочных продуктов [4]; применение прибора «ЯМР-мышь» с односторонним магнитом и датчиком для определения концентрации твердого жира в рыбе, пищевых эмульсиях [10, 14] и растворенного кислорода в гипергазированной минеральной воде [12].

Получены результаты о том, что в модельных смесях, содержащих мицеллярный казеин, сывороточный белок и лактозу, скорость спинспиновой релаксации 1/Т2 протонов воды прямо пропорциональна концентрации казеина [5]. Исследования молочных продуктов различной жирности, продаваемых в розничных магазинах Санкт-Петербурга, показали, что скорость релаксации 1/Т2 протонов воды пропорциональна концентрации общего белка.

Купленные в розничной сети образцы молока и молочной сыворотки имели концентрацию жира в диапазоне 0–6 %, казеина – 0–3 %. Время релаксации Т₂ протонов воды в молоке существенно зависит от pH и температуры. Титруемая кислотность в образцах молока составляла не более 20 ºТ, что соответствует pH примерно 6,51. Измерения проводили при 20 ºС.

Время спин-спиновой релаксации Т₂ протонов воды в молоке измеряли на клиническом ЯМР-томографе «Vectra» фирмы General Electric Medical Systems, США (рис. 1). Индукция магнитного поля томографа составляет 0,5 Т (частота ЯМР на ядрах атома водорода – 21,6 МГц). На томографе также измерено время спин-спиновой релаксации Т₂ с помощью импульсной последовательности (ИП) Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (fastSE sequence). Эта ИП была использована для приближенного измерения времени Т₂ протонов в молоке и сыворотке. Максимальное количество сигналов эха равно 16, что обусловливает существенную погрешность измерений времени Т2. Тем не менее измеренные значения Т₂ удовлетворительно соотносятся с литературными данными, полученным при аналогичных условиях – частоте ЯМР, температуре и pH. Это обусловлено, в частности, тем, что в молоке и сыворотке наблюдается одно-экспоненциальная релаксационная кривая [8, 11]. Источниками ошибок измерений Т₂ также может являться то, что перед проведением измерений не производилась настройка 90- и 180-градусных импульсов. Источником ошибок может быть и ограничение на максимальную паузу TR=6000 мс. Известно, что в молоке время Т₁ – продольной релаксации больше времени Т₂ – поперечной релаксации протонов. Т1 протонов находится в диапазоне 1–2 с [6]. В частности, при измерении Т2 протонов с помощью той же ИП в 3 %-ном растворе нативного казеината фосфора пауза составляла 10 с [5].

В использованном томографе имеется возможность аппроксимации различными функциями экспериментальных точек, полученных в ИП fastSE для произвольной выделенной области (рис. 2). Это позволяет в процессе эксперимента определить время релаксации Т2. В качестве аппроксимирующей функции была выбрана затухающая одиночная экспонента без постоянной составляющей напряжения в приемнике.

Полученные на томографе экспериментальные данные были также аппроксимированы в программах Mathcad и Origin. Обе программы при аппроксимации данных одиночной экспонентой дают примерно одинаковое время релаксации Т2, которое меньше Т2, определенного на томографе «Vectra», примерно на 10 % в диапазоне Т2 от 190 до 500 мс.

Представляется возможным, что кривая Т2 отражает релаксацию протонов не только свободной воды, но и всех остальных соединений: твердого и жидкого жиров, белка и лактозы. Наблюдение этих компонент зависит от их концентрации и времени выборки экспериментальных точек. Если интервал выборки точек мал (порядка 20 мкс), то в диапазоне времени от 0 до 1 мс в релаксационные кривые протоны воды дают вклад релаксационные кривые протонов белка и твердого жира. Более того, время релаксации Т2 протонов жидкого жира сравнимо с временем Т2 протонов воды. Этот факт усложняет интерпретацию релаксационных данных с ростом концентрации жира, например, в сливках 18 %- и 36 %-ной жирности. Интервал выборки в нашем эксперименте очень велик, а концентрации жира сравнительно малы, поэтому мы предполагаем, что наблюдаем сигнал только от протонов воды. Однако при измерении молока «Клевер» 6 %-ной жирности полученная релаксационная кривая не была моноэкспоненциальной. В табл. 1 приведены оценочные величины двух значений Т2 в предположении биэкспоненциальной релаксации. 

Почти во всех экспериментах Т₂ протонов воды измеряли в молоке в закрытой упаковке. Исключение составляли упаковки, содержащие алюминиевую фольгу: электромагнитное излучение частотой 21,6 МГц не проникает внутрь этой упаковки вследствие малой толщины скин-слоя в алюминии, и ЯМР-сигнал от молока отсутствует. Для получения ЯМР-томограмм образцы молока в такой упаковке помещали в отдельную немагнитную емкость – стеклянную банку.

Для каждого образца измерения Т₂ повторялось 3 раза. Исследования показали, что в молоке жирностью 0–3,2 % Т₂ не зависит от концентрации жира в пределах погрешности измерений. Эти результаты аналогичны работе [6], где отмечена та же закономерность для двухмерных функций распределения D- T2, T1- T2, но при более широком диапазоне жирности, включая жирные сливки (более 36 %) и сгущенное молоко. В молоке «Клевер» 6 %-ной жирности было также отмечено наличие двух-экспоненциальной зависимости для релаксационной кривой.

Измеренные значения Т₂ протонов воды в молоке разных производителей (ЗАО «Лактис» и Кингисеппский молочный завод) были одинаковы.

Сравнивая время релаксации Т₂ протонов молока и молочной сыворотки (табл. 2), можно сделать вывод о том, что оба значения Т₂ незначительно зависят от географии производителя, массовой доли сухих веществ в обезжиренном молоке, небольших изменений температуры и pH. Немного завышенные значения Т₂ можно объяснить погрешностью аппроксимации экспериментальных данных. Полученные значения Т₂ протонов молока и сыворотки находятся в удовлетворительном соответствии с литературными данными, что может служить подтверждением корректности методики измерения Т₂ протонов на ЯМР-томографе.

Оценку достоверности полученных результатов проводили, сравнивая график на рис. 3 с аналогичной зависимостью, полученной для модельных смесей, содержащих казеинат фосфора, сывороточный белок и лактозу [5]. Из табл. 1 и 2 видно, что время релаксации Т2 в молоке «LATEO» с концентрацией жира 2,5 % и казеина 3 % совпадает со значением Т2, полученным в 3 %-ном растворе нативного казеината фосфора.

Далее сравнивали тангенс угла наклона линейной зависимости скорости релаксации 1/Т2 (см. рис. 3) от концентрации казеина со значением, приведенным в [5]. Полученное значение тангенса домножили на соответствующий коэффициент, чтобы получить значение в тех же координатах, что и в работе [5]. Тангенс угла наклона в эксперименте – 123 ± 25 (152,2 ± 1,1 [5]), коэффициент корреляции – 0,958 (0,999 [5]), pH – 6,51 (6,6 [5]).

Зависимость скорости релаксации 1/Т2 протонов воды в молоке и сыворотке (с–1) от концентрации казеина описывает уравнение линейной регрессии: Y = A + BX, где X – концентрация казеина; R = 0,95865; SD = 0,57431; N = 4; P = 0,04135; А=1,15617; В=1,23328; СКО – соответственно 0,44486 и 0,25887. Можно сделать заключение о том, что скорость релаксации 1/Т2 протонов воды в молоке, купленном в магазине, приближенно пропорциональна концентрации казеина.

Время релаксации Т₂ протонов воды в разбавленном молоке «LATEO» 2,5%-ной жирности при концентрации казеина 3, 1,5, 0,75 % соответственно 220, 290 и 410 мс.

Таким образом, с помощью предложенного бесконтактного метода может быть обнаружена фальсификация содержания казеина в молочных продуктах, таких как молоко, сгущенное молоко и творог в упаковке. По предварительной оценке, минимальная концентрация казеина, регистрируемая данным методом, составляет менее 0,5 %.

Предлагаемый метод основан на измерении скорости спин-спиновой релаксации 1/Т₂ протонов воды, которая пропорциональна количеству атомов водорода, связанных с казеиновыми мицеллами, вследствие химического обмена и гидратации. Он может быть использован для исследования процессов гидратации мицелл казеина, которые оказывают большое влияние на устойчивость мицелл белка в молоке, структурно-механические свойства белковых сгустков, образующихся при выработке кисломолочных продуктов и сыра, консистенцию готового сыра.

Список литературы

1. Алексеев Г.В., Хрипов А.А., Яковлев А.А. Исследование потребительских свойств молочных продуктов методами магнитной резонансной томографии // Процессы и аппараты пищевых производств. 2010. № 2.

2. Горбатова К.К. Химия и физика молока. – СПб.: ГИОРД, 2003.

3. Илларионова Е.Е., Билал Д.Д. К вопросу фальсификации сухого обезжиренного молока сывороткой. Научное обеспечение молочной промышленности // сб. научных трудов ВНИМИ, 2004.

4. Blu. mich B. Essential NMR for Scientists and Engineers, Springer, 2005, 244.

5. Dean A.Le, Mariette F., Marin M. Le. 1H Nuclear Magnetic Resonance Relaxometry Study of Water State in Milk Protein Mixtures // J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 5449–5455.

6. Hurlimann М.D., Burcaw L. and Song Y. Quantitative Characterization of Food Products by two dimensional D – T₂ and T₁ – T₂ Distribution Functions in a Static Gradient // J. Colloid. Inter. Sci., 2006.

7. Mariette F. NMR Relaxation of Dairy Products, Modern Magnetic Resonance (ed. G. A. Webb), 2008, 1697–1701.

8. Mariette F. NMR Imaging of Dairy Products, Modern Magnetic Resonance (ed. G. A. Webb), 2008, 1801–1806.

9. Perlo J., Casanova F., Blu. mich B. // Science, 2007, 315, 1110.

10. Pedersen H.T., Ablett S., Martin D.R., Mallett M.J.D., Engelsen S.B. Application of the NMR- MOUSE to food emulsions // J. Magn. Reson. 2003, 165, 49–58.

11. Roefs S.P.F.M., Van As H., Van Vliet T. Pulse NMR of Casein Dispersions // J. Food Sci., 54, 3, 1989, 704–708.

12. Stork H., Gadke A., Nestle N. Single-Sided and Semisingle-Sided NMR Sensors for Highly Diffusive Samples: Application to Bottled Beverages // J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 5247–5252.

13. Tellier C., Mariette F., Guillement J., Marchalx P. Evolution of Water Proton Nuclear Magnetic Relaxation during Milk Coagulation and Syneresis: Structural Implications // J. Agric. Food Chem. 1993, 41, 2259–2266.

14. Veliyulin E., Van der Zwaag C., Burk W., Erikson U. In vivo determination of fat content in Atlantic salmon (Salmo salar) with a mobile NMR spectrometer // J. Sci. Food Agric. 2005, 85, 1299–1304.

15. Wahlgren M., Drakenberg T. In: GA Webb, P Belton, MJ Mc Carthy (Eds). Annual Reports on NMR Spectroscopy. – Academic Press: London, 1995, p. 275.

16. Weekley A.J., Bruins P., Augustine M.P. Am. J. Enol. Vitic, 2002, 53, 4.

Источник: журнал "Молочная промышленность". 2014. № 2.