Анализ методов оценки общей бактериальной обсемененности молока-сырья при входном контроле на предприятиях молочной отрасли

Качество и безопасность молочной продукции в значительной степени зависят от используемого молокасырья. Одним из основных показателей безопасности молока сырого, нормируемого по ТР ТС 033/2013, является показатель общей бактериальной обсемененности, характеризующий уровень микробного загрязнения поступающего на перерабатывающие предприятия молока. Микробное загрязнение молокасырья формируется от различных источников (микрофлора вымени и кожных покровов животного, оборудование и инвентарь, вода, воздушная среда, персонал) и зависит от санитарно-гигиенических условий при получении, хранении и транспортировке молока, а также здоровья животных, качества кормов. Кроме того, на уровень бактериальной обсемененности молока-сырья влияют наличие или отсутствие условий для возможного развития исходной микрофлоры, т.е. режимы охлаждения молока после дойки, а также температура и продолжительность хранения его до переработки. 

Анализируя молоко сырое как значимую точку риска, следует учитывать сложность и неоднозначность критерия «бактериальная обсемененность». С одной стороны, это общий суммарный уровень содержания микроорганизмов в молоке – показатель КМАФАнМ, с другой – разнообразный бактериальный пейзаж, т.е. видовой состав микрофлоры, определяющий безопасность и качество молочных продуктов. Оценка бактериального пейзажа более 150 образцов сырого молока со средним уровнем бактериальной обсемененности (2,1±0,8)×105 КОЕ/см³ показывает, что господствующая микрофлора представлена БГКП – (2,2±3,3)×104 НВЧ кл./см³; молочнокислыми мезофильными (4,8±3,3)×104 КОЕ/см³ и термофильными микроорганизмами, в том числе термофильным стрептокок- ком – (1,0±1,9)×104 КОЕ/см³; а также группой психротрофных микроорганизмов – (5,0±4,4)×103 КОЕ/см³. 

В состав микрофлоры сырого молока, которая не влияет на величину показателя КМАФАнМ, но является крайне значимой для качества молочных продуктов, в том числе сыров, входят дрожжи – (1,2±0,8)×103 КОЕ/см³; плесневые грибы – (1,5±1,1)×102 КОЕ/см³; споровые факультативно-анаэробные бактерии – (6,3±3,0)×101 КОЕ/см³; споровые анаэробные бактерии (коли- чество спор в исследованных образцах не превышает 25 НВЧ спор/см³). Содержание данных групп микроорганизмов не значимо относительно общей бактериальной обсемененности сырого молока, но именно они в конечном итоге становятся микрофлорой порчи молочных продуктов. Показатель КМАФАнМ, определяемый в сыром молоке, не говорит о бактериальном пейзаже, а показывает общую бактериальную обсемененность, характеризующую санитарно-гигиенические условия получения, хранения и доставки молока на молокоперерабатывающее предприятие. Требования к молоку сырому по бактериальной обсемененности, установленные ТР ТС 033/2013  и действующими документами по стандартизации, представлены в табл. 1. 

В соответствии с ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа» для определения бактериальной обсемененности молока сырого в качестве арбитражного метода используется стандартный чашечный метод посева определенных разведений исходного молока на твердую питательную среду КМАФАнМ с последующими культивированием в течение 72 ч при (30±1) °С и подсчетом колоний образующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Для определения бактериальной обсемененности молока используется питательная среда КМАФАнМ – плотная питательная среда общего назначения. Питательная среда КМАФАнМ в соответствии с патентом ВНИИМС № 2358010 «Модифицированная сухая питательная среда КМАФАнМ для определения общего количества бактерий» содержит ферментативный гидролизат белков молока (50,0–54,0 мас.%); лактозу (20,0–24,0 мас.%); дрожжевой автолизат (4,0–4,2 мас.%); калий фосфорнокислый двузамещенный (1,9– 2,1 мас. %) и агар (24,0–30,0 мас.%). 

Для проведения входного контроля молока сырого, а также выходного контроля готовой продукции использование сред иного состава не соответствует требованиям действующих нормативных документов, в том числе ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа». Среда КМАФАнМ, выпускаемая во ВНИИМС в соответствии с патентом на изобретение № 2358010, обеспечивает рост единичных клеток и создает условия для развития тех микроорганизмов, которые способны расти и размножиться в молоке и молочных продуктах. Для проверки ростовых свойств среды КМАФАнМ в качестве тесткультуры используется смесь чистых культур молочнокислых микроорганизмов рода Lactococcus и рода Leuconostoc, выбранных в качестве типичных представителей факультативно-анаэробных мезофильных хемоорганотрофных микроорганизмов. Среда считается пригодной для выполнения микробиологических анализов при выявляемости тест-культуры в посевах в количестве не менее 1×109 КОЕ/см³ с формированием характерных по внешнему виду и размеру колоний. Размер колоний, образуемых на чашках и подлежащих подсчету, имеет важное значение: чем больше диаметр колонии, тем выше вероятность того, что она будет визуально замечена и учтена при подсчете. Хотя чашечный метод определения показателя КМАФАнМ принято считать арбитражным, в зависимости от качества используемой среды и квалификации конкретного исполнителя данный метод может иметь значительную ошибку. Об этом свидетельствуют результаты посевов сырого молока специалистами, обучающимися на курсах повышения квалификации во ВНИИМС. При выполнении исследований одной и той же пробы молока с использованием одних и тех же средств контроля группой микробиологов различия в результатах колеблются в пределах порядка (табл. 2). 

Основным ограничивающим фактором при использовании чашечного метода является длительность анализа, так как большинству микро- организмов для образования видимых колоний необходимо не менее 2–3 сут, что не позволяет проводить оценку поступающего молока в режиме реального времени. В качестве экспресс-метода для оценки уровня бактериальной обсемененности молока сырого ГОСТ 32901-2014 предполагает возможность применения редуктазной пробы. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими ферментами, дегидрогеназы (редуктазы бактериального происхождения), которые входят в класс оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока. Метод основан на восстановлении индикатора резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По интенсивности изменения окраски резазурина через 1 ч оценивают уровень бактериальной обсеменности сырого молока. 

Метод может быть реализован двумя способами – как с использованием рабочего раствора резазурина, так и с применением микробитестов для определения дегидрогеназной активности. Оба способа дают идентичные результаты. Микробитесты по ТУ 9291-088-04610209-2000 «Диагностический препарат для определения дегидрогеназной активности» разработаны и выпускаются ВНИИМС. Результаты, полученные с использованием микробитестов, следует рассматривать как более надежные, так как качество микробитестов гарантировано производителем. 

Основные преимущества оценки уровня бактериальной обсемененности молока редуктазной пробой: 

• метод крайне прост в исполнении и не требует специального оборудования; 
• малозатратный, не требующий дорогостоящих реактивов;
• проверенный многолетним опытом применения в промышленности. 

Основные недостатки метода: 

– низкая чувствительность (порог чувствительности составляет 3×105 КОЕ/см³); 
– дает возможность определить уровень бактериальной обсемененности до 500 тыс. в 1 см³ молока или более 500 тыс. в 1 см³ молока без конкретных показателей количества бактериальных клеток. 

В отделе микробиологии ВНИИМС на протяжении многих лет ведутся постоянные исследования не только микрофлоры молока и молочных продуктов, но и методов их контроля. В период с 2013 по 2016 г. в отделе микробиологии проводились исследования по определению бактериальной обсемененности сырого молока с использованием нового отечественного прибора турбидофлуориметра БиоТФ (Государственный реестр СИ № 56270-14). Прибор разработан специалистами фирмы ООО «ИНТЕЛБИО» и не имеет зарубежных аналогов. Принцип действия турбидофлуориметра БиоТФ основан на свойствах света рассеиваться и поглощаться поверхностью взвешенных в жидкости частиц и на оптическом явлении флуоресценции – свечении вещества при возбуждении светом фиксированного диапазона длин волн. Результаты измерения флуоресценции в мутных растворах нормируются результатами параллельных турбидиметрических определений.

Турбидофлуориметрия – оптическая технология, используемая для измерения крайне низких значений флюоресценции в мутных растворах биологических жидкостей. Математическая и статистическая обработка динамических значений интенсивности флуоресценции на основе кинетики и стехиометрии микробного роста позволяют точно рассчитать общее количество микроорганизмов. Данный метод получил условное название: биокинетический анализ динамики флуоресценции в процессе метаболизма флуорогенного субстрата микроорганизмами. Испытания турбидофлуориметра БиоТФ проводились на молоке, поступающем из хозяйств Угличского района в Испытательный центр «ТЕСТ-МС». Проведены сравнительные испытания 320 образцов сырого молока. Бактериальную обсемененность в образцах молока определяли параллельно арбитражным чашечным методом на среде КМАФАМ и приборным методом с использованием турбидофлуориметра БиоТФ. Графическая зависимость для общего массива данных, полученных при определении бактериальной обсемененности молока арбитражным методом на среде КМАФАнМ и с использованием турбидофлуориметра БиоТФ, представлена на рис. 1. 

Основной критерий сходимости методов – коэффициент линейного уравнения (1,025), при этом свободный член линейного уравнения (0,0281) несет информацию о сдвиге методов. Коэффициент линейного уравнения в полученной зависимости близок к единице, а свободный член – к нулю, что свидетельствует о высокой сходимости методов  определения бактериальной обсемененности приборным экспресс-методом с использованием турбидофлуориметра и показателя КМАФАнМ, определяемого арбитражным чашечным методом в соответствии с ГОСТ 32901.

 В результате проведенных исследований разработан и введен в действие с 1 января 2020 г.  ГОСТ 34472-2018 «Молоко сырое. Турбидофлуориметрический экспресс-метод определения бактериальной обсемененности». Настоящий стандарт распространяется на приборный турбидофлуориметрический экспресс-метод определения бактериальной обсемененности сырого молока по интенсивности флуоресценции веществ, образующихся из флуорогенного субстрата, в процессе жизнедеятельности микроорганизмов. Метод определяет биомассу клеток в исходной пробе молока, которую затем автоматически пересчитывает в показатель КОЕ. Метод напрямую не фиксирует количество жизнеспособных клеток, которые затем определяются показателем КОЕ, однако максимально объективно, в сравнении с другими косвенными методами, приближается к оценке именно этого показателя. Данный приборный метод позволяет проводить измерения бактериальной обсемененности сырого молока в диапазоне от 2×104 КОЕ/см³ до 5×106 КОЕ/см³. 

В соответствии с ГОСТ 34472-2018 под бактериальной обсемененностью понимается количество аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных микроорганизмов, способных проявлять свою жизнедеятельность в сыром молоке при температуре 30 °С. В сыром молоке подавляющее количество микрофлоры представлено мезофильными аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами. При посеве сырого молока для определения КМАФАнМ  не учитываются анаэробные бактерии, количество которых ничтожно по сравнению с общим количеством выявляемых микроорганизмов. Поэтому разницей между показателями бактериальной обсемененности и КМАФАнМ в сыром молоке следует пренебречь. Выполнение анализов турбидофлуориметрическим методом предполагает соблюдение некоторых особенностей. 

Флуоресцентная технология БиоТФ позволяет проводить измерение непосредственно в образце молока, отказавшись от разведений и анализируя микроорганизмы во всем объеме представительной пробы. Однако точность измерения во многом определяется однородностью распределения клеток микроорганизмов, поэтому пробу молока для анализа перед выполнением измерений необходимо тщательно перемешивать. Второе важное условие получения точного результата – предварительный подогрев сырого молока в микропробирке в течение 10 мин в оптическом облучающем подогревателе. Подогретую пробу молока переносят в тестовую пробирку, перемешивают на встряхивателе вибрационного типа в течение 10–15 с и помещают в турбидофлуориметр для выполнения измерений.

Для формирования протокола исследования используют программное обеспечение БиоТФ, которое собирает и обрабатывает данные турбидофлуориметра в соответствии с методикой выполнения измерения «Старт», формализованной в виде программного приложения. Измерение начинается и заканчивается автоматически. Программное обеспечение «БиоТФ» рассчитает общее количество микроорганизмов в 1 см3 молока. В зависимости от степени обсемененности молока время измерения составляет от 8 до 20 мин. После завершения измерения результат появится на мониторе в протоколе испытаний (рис. 2). 

Таким образом, для проведения исследований бактериальной обсемененности сырого молока при приемке на переработку возможно применение трех ГОСТированных методов: 

• чашечного арбитражного метода путем посева молока в среду КМАФАнМ в соответствии с ГОСТ 32901-2014; 
• редуктазной пробы – экспресс-метода для определения уровня бактериальной обсемененности в соответствии с ГОСТ 32901-2014; 
• приборного экспресс-метода на основе турбидофлуориметрии в соответствии с ГОСТ 34472-2018.

Источник: журнал "Переработка молока". 2020. № 4.