Влияние акустического воздействия ультразвука на биосинтез экзополисахаридов и реологические свойства кисломолочных продуктов, полученных на основе кефирного грибка

В качестве объектов исследования были выбраны кисломолочные продукты, в основе производства которых использовали восстановленное при помощи ультразвукового воздействия молочное сырье. Исследования показали, что сквашивание кефиров на закваске кефирного грибка протекало интенсивнее, чем в остальных образцах: через (6 ± 0,5) часов сквашивания титруемая кислотность смеси достигла (85 ± 2) °Т. Интенсивное нарастание титруемой кислотности позволяет сократить процесс сквашивания на 2–3 часа. Применение ультразвуковой кавитации на этапе подготовки молочного сырья к сквашиванию влияет на устойчивость сгустка к самопроизвольному уплотнению структуры: наибольший объем отделившейся сыворотки наблюдался у образцов, молоко для которых обрабатывалось в режиме УЗВ (мощность 60 %, длительность 3 минуты). 

Результаты исследований показали, что применение УЗВ в режиме 3 минуты при 30 % мощности для обработки сырого молока в технологии кефира, полученного с применением закваски кефирного грибка, снизило отделение сыворотки от сгустка в 1,4 раза, а для кисломолочного напитка на основе комбинированной закваски – в 1,5 раза. При микроскопировании фиксированных препаратов выявлено, что сгустки, полученные на основе симбиотической закваски кефирного грибка, характеризуются однородной консистенцией с меньшими агрегатами молочного белка и большим количеством комплексов белка небольшого размера, по сравнению с образцами, полученными на основе комбинированной закваски, содержащей культуры Lac. lactis, Lac. cremoris, Leu. cremoris, Lactobacillus kefir, Аcetobacter subsp. аceti, Saccharomyces lactis. Динамика накопления кефирана в кисломолочных напитках находится в прямой зависимости от режимов УЗВ и активности заквасочных культур. Таким образом, накопление растворимых полисахаридов в кисломолочных напитках, как фактора, определяющего их функциональные свойства, необходимо регулировать режимами ультразвукового воздействия.

Введение
В настоящее время исследования в области питания направлены не только на разработку норм количественного потребления продуктов питания, но и на обоснование качественных аспектов, основу которых составляют принципы сбалансированности питания. Мировое научное сообщество рассматривает кисломолочные продукты в качестве основы здорового питания человека, способствующей сохранению здоровья, предупреждению ряда заболеваний и увеличению продолжительности жизни [1, 3, 15]. Наряду с благоприятным влиянием на нормальную микрофлору кишечника, кисломолочные продукты, в том числе кефир и кефирные напитки, выполняют функции обеспечения организма необходимыми эссенциальными и биологически активными веществами.

Сообществом ученых доказано, что потребление кефира благоприятствует усвоению белка, стимулирует иммунную систему, улучшает пищеварение. Кефир обладает противовоспалительным и противоаллергическим действием [8, 12], низким гликемическим индексом, что определяет терапевтический потенциал в лечении аллергической бронхиальной астмы и диабета, обладает противобактериальным, противоопухолевым действием. Кефир является сложным продуктом, содержащим кроме продуктов молочнокислого и спиртового брожения живые клетки молочнокислых бактерий, дрожжи и продукты их метаболизма. Известно, что кефирные грибки являются уникальной симбиотической системой, которая представляет собой эволюционно сложившуюся ассоциативную культуру. Действительно, микроорганизмы в сообществах более устойчивы к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, лимитированию субстратами и др. В таких сообществах между видами конкуренция обнаруживается редко. Даже когда один из видов благодаря более высокой скорости роста занимает
господствующее положение, другие сохраняют жизнеспособность [2, 10, 13, 17].

Микроорганизмы кефирных грибков проявляют антагонизм по отношению к C. albicans, к мицелиальным грибам родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella, причем ингибирующее действие на рост грибов оказывают не только микроорганизмы кефира, но и их метаболиты, образуемые в процессе культивирования. Современные исследования объясняют механизмы взаимодействия между бактериями в кефирных грибках. Две гетероферментативные бактерии L. kefir и L. parakefir обладают поверхностным белковым слоем (Slayer), чем и объясняется их способность к самоагрегации и агглютинации. Эти бактерии способны удерживаться на клетках Сасо-2 (аденокарциномы толстого кишечника человека), тем самым показывая хорошие пробиотические свойства данных бактерий [8, 9, 16].

Несмотря на то, что сегодня в нашей стране среди населения все больше доминирует тенденция здорового образа жизни, тем не менее, объем потребления кефира и кефирных продуктов на душу населения составляет всего 7,4 кг в год. Хотя в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 2 августа 2010 г. № 593н рациональный объем потребления кефира и кефирных продуктов на одного человека в год должен составлять порядка 36 кг в год [4].

Практически все молокоперерабатывающие предприятия осуществляют выработку кефира и кефирной продукции. В 2014 году, по сравнению с 2013-м, объем производства кефира и кефирной продукции в РФ сократился на 1,2 % в натуральном выражении, или на 12,714 тысячи тонн. Эффективному развитию российского рынка кефира и кефирных продуктов в значительной степени препятствует сезонность производства, обусловленная динамикой сырьевого рынка. Сегодня производство кефирной продукции и кефира в основном выстроено на использовании лиофилизированных заквасок прямого внесения, так как технология производства собственных кефирных заквасок весьма кропотлива и требовательна к условиям.

Патентный поиск в области разработок, связанных с кисломолочными продуктами, показал, что около 30 % разработок приходится на кисломолочные продукты с пробиотиками, 8 % – с пребиотиками, около 20 % – разработки, связанные с использованием вторичных продуктов переработки молочного сырья, более 10 % – с биологически активными веществами и такое же количество со стабилизирующими консистенцию системами.

Так, известен способ производства кефирного напитка (патент РФ 2409962) на основе внесения кедрового жмыха в количестве 0,5 %, а также внесение сиропа лактулозы в количестве 1,0 %. Изобретение позволяет получить напиток, обладающий высокими органолептическими показателями, бифидогенными свойствами, повышенной пищевой и биологической ценностью и хранимоспособностью.

Способ ускоренного производства кефира (Патент РФ № 2010116681/10) включает сквашивание пастеризованного охлажденного молока с омагниченной напряженностью суспензией из молока и кефирной закваски. При производстве кефира для детского и диетического питания (Патент РФ 2105485) предлагается проводить деаэрацию молока до внесения кефирной закваски и биомассы бифидобактерий.
Особый интерес представляют разработки в области исследования способов, благоприятствующих накоплению полисахаридов, продуцированных молочнокислыми микроорганизмами. Одним их таких ценных полисахаридов молочнокислых бактерий является экзополисахарид (ЭПС) кефиран, продуцируемый кефирными грибками, который служит матрицей для удерживания, иммобилизации клеток микробных компонентов кефирных грибков. Кефиран производится некоторыми молочнокислыми бактериями, состоит из остатков глюкозы и галактозы (рис. 1) примерно в равном соотношении (1:1). Причем это соотношение может варьироваться в зависимости от условий культивирования и географического происхождения кефирных грибков. Известно, что кефиран влияет на реологические свойства кисломолочного продукта, выполняет функции стабилизатора, эмульгатора и влагоудерживающей системы [5, 16, 18, 19].

Кефиран обладает иммуномодулирующим, противоопухолевым, противовоспалительным, противоастматическим, ранозаживляющим действием. Он способствует снижению кровяного давления и уровня холестерина в крови за счет связывания гепатоэнтерально циркулирующего холестерина в кишечнике. Обладает ингибирующим действием в отношении патогенных микроорганизмов рода Salmonella, Helicobacter, Shigella, Staphylococcus, и Escherichiacoli [18, 19]. Доказано, что ЭПС выступают в качестве механизма адаптации заквасочных микроорганизмов в среде молока, причем в зависимости от конкретных условий синтезируются экзополисахариды различного состава и свойств [6]. Экстракция данного минорного БАВ в промышленных масштабах и последующее его применение в технологии молочных продуктов представляется весьма сложной и дорогостоящей, поэтому интерес представляют более простые в техническом отношении методы [6, 10]. В связи с чем одним из перспективных подходов к решению различных технологических задач в пищевой отрасли является ультразвуковое кавитационное воздействие на гетерогенные пищевые среды с жидкой фазой. Применение ультразвуковых кавитационных технологий, по сравнению с известными физическими способами, имеет ряд существенных преимуществ, обусловленных совокупностью специфических эффектов, которые оказывают комплексное действие, направленное на интенсификацию технологического процесса формирования потребительских свойств. 

Особенности протекания акустических ультразвуковых процессов в различных средах и их результаты активно изучаются О.Н. Красулей, С.Д. Шестаковым, Н.В. Дежкуновым, А.Г. Галстяном, M. Ashokkumar, D. Knorr, K.S. Suslick и другими авторами [7, 11, 14]. Коллективом ученых под
руководством Н.А. Тихомировой, ведутся разработки в области модифицирования свойств цельного молока, используемого для производства кисломолочной продукции и творога. В частности, установлено, что совместная кавитация цельного молока с некоторым количеством сухого способствует изменению его дисперсности и углеводного состава, гомогенизирует и стабилизирует структуру.

Цель исследования – установление влияния акустических эффектов ультразвуковой кавитации на накопление экзополисахарида кефирана и реологические свойства сгустков кисломолочных напитков, ферментированных на основе кефирного грибка.

Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали модельные образцы кисломолочных напитков, подготовленные в лабораторных условиях по традиционной (ТТИ ГОСТ Р 52093-005 «Кефир») и модифицированной с применением УЗВ технологий:


Рис. 1. Химическая структура кефирана. 


− кефир, полученный с применением закваски кефирного грибка (ККГ);
− кисломолочный напиток на основе закваски прямого внесения 
− LAT LC К, состоящая из Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp.cremoris, Lactobacillus kefir, Acetobacter subsp. aceti, Saccharomyces lactis в иммобилизованном виде (ККЗ);

− кисломолочный напиток на основе комбинированной закваски (ККГ+КЗ).

В качестве акустического источника упругих колебаний использовался аппарат ультразвуковой технологический «Волна» модель УЗТА-О,4/22-ОМ (частота механических колебаний 22 ± 1,65 кГц).
Каждому из объектов исследования были определены условия ультразвукового воздействия с учетом вариаций по мощности (120 Вт – 30 % от паспортной, 180 Вт – 45 % от паспортной, 240 Вт – 60 % от паспортной) (табл. 1).


В исследованиях использовались как стандартные, так и современные физико-химические, биохимические и микробиологические методы исследований.
Морфологию микрофлоры закваски изучали путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим и по Грамму, с последующим микрокопированием в иммерсионной системе с объективом с нанесением каплей кедрового масла.
Титруемую кислотность молочного сырья и продуктов переработки определяли титрометрическим методом с применением индикатора фенолфталеина (ГОСТ 3624), активную кислотность определяли потенциометрически с помощью рН-метров: рН-150, WTW pH/Cond 340І и стеклянного электрода ЭСЛ-15-11 в паре с хлорсеребряным ЭВЛ-1М4 (по ГОСТ 26781).
Динамическую вязкость оценивали посредством определения предельного напряжения сдвига, на вискозиметре ротационном Brookfield DV-III Ultra. Диапазон вязкости определяли от 1 мПа·c до 6×106 мПа·c, диапазон скоростей – 0,01…250 об/мин. Определение степени синерезиса кисломолочных напитков осуществляется путем измерения количества сыворотки, выделившейся за 1 час свободного фильтрования 100 см3 продукта.
Количественное определение полисахарида (кефирана), производимого молочнокислыми бактериями, определяли по методу, предложенному Р. Еникеевым [6].

Результаты и их обсуждение
Изучение влияния акустических эффектов ультразвука проводили в несколько этапов.
Производственную закваску на кефирном грибке вносили в количестве 5 % от массы заквашиваемой смеси. Культивирование осуществляли при температуре (23 ± 1) °С в течение 10…12 часов. Последующее созревание продукта проводили в течение 10…12 часов в условиях бытового холодильника (t = 4…10 °C). Комбинированную закваску, состоящую из закваски прямого внесения (сухой заквасочной культуры LAT LC K) в сочетании с закваской на кефирном грибке.

Комплексная оценка сгустков проводилась по следующим параметрам:
1) динамика процесса сквашивания – по показателю «титруемая кислотность» и показателю «активная кислотность» (pH);
2) оценка структурного состояния сгустков – по органолептическим показателям (консистенция и внешний вид); показателю «эффективная вязкость» и синеретическим свойствам сгустков (синерезис);
3) функциональные свойства – по массовой доле кефирана; составу микрофлоры (качественный и количественный состав);
Исследования титруемой и активной кислотности осуществляли через каждый час в течение всего периода сквашивания.
Процессы сквашивания протекали идентично (табл. 2), наблюдалось некоторое снижение интенсивности кислотообразования в первые два часа для образцов, полученных на основе УЗВ, а затем – активизация процесса накопления молочной кислоты.
Исследования показали, что сквашивание кефиров на закваске кефирного грибка (образец ККГ 3-60 и ККГ 3-45) протекало интенсивнее, чем в остальных образцах. Так, через (6 ± 0,5) часов сквашивания титруемая кислотность смеси достигла (85 ± 2) °Т. Интенсивное нарастание титруемой кислотности позволяет сократить процесс сквашивания на 2–3 часа. Другие образцы сквашивались гораздо медленнее, рекомендуемый уровень титруемой кислотности (85 °Т) в сгустках ККГ 5-30 и ККГ+КЗ 5-30 был достигнут через (9 ± 0,5) часов сквашивания.



УЗВ высокой мощности обеспечивает дисперсность молочной системы и, как следствие, биодоступность белков молока к действию бактериальных ферментов. Развитие заквасочной микрофлоры и активность ферментов зависят от рН. Оптимальное значение рН для сквашенных продуктов на отдельных этапах производства составляет: начало охлаждения – 4,6–4,7; начало перемешивания 4,2–4,6; готовый продукт 4,0–4,4. Активная кислотность образцов кефира в конце сквашивания (рис. 2) достигла оптимума для всех напитков на закваске кефирного грибка (ККГ) и заквасочной смеси (ККГ+КЗ). Органолептические свойства, в том числе консистенция кисломолочных напитков, взаимосвязаны с показателем активной кислотности (рН).

Структурно-механические свойства, влагоудерживающая способность, синергетические свойства зависят в большей степени от состава молока, режимов тепловой и механической обработки. Применение ультразвуковой кавитации на этапе подготовки молочного сырья к сквашиванию повлияло на устойчивость сгустка к самопроизвольному уплотнению структуры. Так, динамика отделения сыворотки от сгустка (рис. 3) имела различную скорость, особенно это проявилось в первые 30 мин наблюдений. Средний прирост объема составлял для контроля от 5,5 до 9 мл, сгусток с режимом обработки УЗВ 3-60 для всех видов заквасок в первые пятнадцать минут слабо удерживал сыворотку, объем истечения 17 мл
для ККГ и 13 мл для ККГ+КЗ.

В последующие периоды объем истечения находился в диапазоне от 4 до 2 мл. Наибольший объем отделившейся сыворотки был у образцов, молоко для которых обрабатывалось в режиме УЗВ мощность 60 %, длительность 3 минуты. Из приведенных данных видно, что применение УЗВ в режиме 3 минуты при 30 % мощности для обработки сырого молока в технологии ККГ снизило отделение сыворотки от сгустка в 1,4 раза, а для ККГ+КЗ – в 1,5 раза.

При микрокопировании экспериментальных образцов наблюдалась типичная для данных видов заквасок микрофлора, посторонних микроорганизмов не обнаружено. Вместе с тем, при микроскопировании фиксированных препаратов выявлено, что сгустки, полученные на основе симбиотической закваски КГ, характеризуются однородной консистенцией с меньшими агрегатами молочного белка и большим количеством комплексов белка небольшого размера, по сравнению с образцами, полученным на основе комбинированной закваски ККГ+КЗ, содержащий культуры Lac.lactis, Lac.cremoris, Leu.cremoris, Lactobacillus kefir, Аcetobacter subsp. аceti, Saccharomyces lactis (табл. 3).

Основными морфологическими типами микрофлоры в исследованных образцах являлись стрептококки, диплококки, палочки, дрожжи. Дрожжи существенно преобладали над кокковой микрофлорой по мере увеличения мощности УЗВ. В образцах кефира дрожжи присутствовали практически в каждом поле зрения, в отличие от кефирного продукта, полученного на основе комбинированной закваски. При выработке кефира с использованием грибковой закваски уровни БГКП и S. aureus во время сквашивания и созревания не увеличивались.


Исследование дисперсной системы кисломолочных напитков показало, что образцы ККГ 3-45 и ККГ 3-60 отличались зернистыми комплексами молочного белка, образующих в общей массе продукта неоднородные зоны большей или меньшей плотности, сгруппированные как в небольшие комплексы, так и в крупные агрегаты.



Динамика накопления кефирана в кисломолочных напитках находится в прямой зависимости от режимов УЗВ и активности заквасочных культур. Так, при приготовлении кисломолочных напитков с использованием закваски КГ количество кефирана составляет 164,24…204,94 мкг/г. В напитках, полученных на комбинированной закваске ККГ+ЗК продуцируется кефирана меньше и его содержание колеблется в диапазоне 187,7–190,7. На рис. 4 наглядно отражено влияние экспозиции УЗВ на накопление ЭПС, кривые линий тренда имеют разную степень кривизны, но, тем не менее, коррелируют с кривыми вязкости.

Структурные характеристики кисломолочных напитков обусловлены дисперсностью белковых частиц, структурой сгустков и их устойчивостью. Известно, что структура кефиров представляет собой крупные сгустки белковых частиц с вязкостью в диапазоне 30–90 mPa. В наших исследованиях значения показателя вязкости варьировало в диапазоне 58,5 до 149 mPa в образцах кефира на КГ и в диапазоне от 74,3 до 100,19 mPa в образцах кисломолочных напитков, полученных сквашиванием на комбинированной закваске ККГ+КЗ.



Следовательно, можно полагать, что накопление растворимых полисахаридов в кисломолочных напитках как фактора, определяющего их функциональные свойства, необходимо регулировать. Возможно, за счет эффектов ультразвукового воздействия. В связи с чем последующие исследования были направлены на поиск путей регулирования процессов формирования потребительских свойств кисломолочных напитков, а также процессов накопления кефирана при наращивании микробной биомассы кефирного грибка.

Заключение
В процессе исследования было доказано, что применение кавитационных эффектов в модернизации технологии восстановленных продуктов переработки молока, повышение их качества, улучшение функциональных свойств продукта. Данные, полученные в ходе работы, дают основание для рекомендации использования кавитационного ультразвукового реактора в технологии йогуртовых продуктов. Это будет являться новым подходом, позволяющим обеспечить потребителей функциональной продукцией высокого качества.

Литература
1. Арсеньева, Т.П. Основные вещества для обогащения продуктов питания / Т.П. Арсеньева, И.В. Баранова // Пищевая промышленность. – 2007. – № 1. – С. 6–8.
2. Артюхова, С.И. Кисломолочные десертные продукты для функционального питания / С.И. Артюхова, A.A. Макшеев. – Омск: Омский научный вестник, 2007. – 77 с.
3. Артюхова, С.И. Молочная сыворотка в функциональных продуктах / С.И. Артюхова, A.A. Макшеев, Ю.А. Гаврилова // Молочная промышленность. – 2008. – № 12. – С. 63.
4. Доктрина продовольственной безопасности Российской Федерации Указ Президента Российской Федерации от 30 января 2010 года № 120 // Российская газета. – Федеральный выпуск № 5100(21). – 3 февраля 2010 г
5. Еникеев, Р.Р. Разработка технологии производства кефира с повышенным содержанием полисахарида кефирана: автореф. дис. кандидата. техн. наук: 05.18.04 / Р.Р. Еникеев. – Самара, 2011. – 23 с.
6. Патент RU 2437092 от 23.03.2010 «Способ количественного анализа полисахарида, производимого молочнокислыми бактериями» / Р.Р. Еникеев, Д.Н. Бобошко, Е.Ю. Руденко, А.В. Зимичев; заяв. и патентообл. Самарский государственный технический университет.
7. Потороко, И.Ю. Системный подход в технологии водоподготовки для пищевых продуктов / И.Ю. Потороко, Р.И. Фаткулин, Л.А. Цирульниченко // Вестник ЮУрГУ. Серия «Экономика и менеджмент». – 2013. – Т. 7, № 3. – С. 153–158.
8. Рощупкина, Н.В. Функциональные ингредиенты для молокосодержащих продуктов и спредов / В.Н. Рощупкина, А. Тихонова // Сыроделие и маслоделие. – 2011. – № 2. – С. 50–51.
9. Технический регламент ТС 033/2013. О безопасности молока и молочной продукции. – http://docs.cntd.ru/document/499050562
10. Хамагаева, И.С. Влияние условий автоселекции на биосинтез экзополисахаридов и адгезивную активность микробного консорциума /И.С. Хамагаева, Т.Н. Занданова, Н.А. Замбалова // Вестник Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления. – 2013. – № 2. – С. 57–62.
11. Хмелев, В.Н. Многофункциональные ультразвуковые аппараты и их применение в условиях малых производств, сельском и домашнем хозяйстве: научная монография / В.Н. Хмелев, О.В. Попова. – Барнаул: Изд. АлтГТУ, 1997. – 160 с.
12. Cheirsilp B., Shimizu H., Shioya S. Modelling and optimization of environmental conditions for kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens
// Appl. Microbiol. Biotechnol, 2001, Vol. 57. – P. 639–646.
13. Fox, P.F. Milk proteins: molecular, colloidal and functional properties/ P.F. Fox, D.M. Mulvihill// J. Dairy Res. – 1982. – V. 49. – № 4. – P. 679–693.
14. Lahey, R. Sonofusion technology revisted / R. Lahey, R. Taleyarkhan and R. Nigmatulin // Nuclear Eng. and Design. – 2007. – V. 237. – P. 1571–1585.
15. Macfarlane G.T., Steed H., Macfarlane S. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosacharides and other prebiotics // Appl. Environ. Microbiol. – 2008. – Vol. 104. – № 2. – P. 305–344.
16. Maeda H., Zhu X., Mitsuoka T. Effects of an exopolysaccharide (kefiran) from Lactobacillus kefiranofaciens on blood glucose in KKAy mice and constipation in SD rats indused by lowfiber diet // Bioscience Microflora, 2004, Vol. 23, № 4. – P. 149–153.
17. Rodrigues K.L. et al. Antimicrobial and healing activity of kefir and kefiran extract // International Journal of Antimicrobial Agents, 2005, Vol. 25. – P. 404–408.
18. Shiomi M. Et al. Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from kefir grain // Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1982, Vol. 35, № 2. – P. 75–80.
19. Yokoi H., Watanabe T. Optimum culture conditions for production of kefiran by Lactobacillus sp. KPB-167B isolated from kefir grains //  Journal of Fermentation and Bioengeneering, 1992, Vol. 74, № 5. – P. 327–329.

Источник: Вестник ЮУрГУ. Серия «Пищевые и биотехнологии». 2016. Т. 4, № 4. С. 14–25